Effect van nicotinamide mononucleotide op hersenen mitochondriale respiratoire tekortkomingen bij een relevante ziekte van Alzheimer Murine Model-4

immunoblotting

Eiwitten zoals bepaald door [24] uit hersenhomogenaten of niet-synaptische mitochondriën (50 μg ) van APP (swe) / PS1 ( Δ E9) en hun niet-transgene nestgenoten (3 maanden) werden opgelost met natriumdodecylsulfaatpolyacrylamidegel elektroforese (SDS-PAGE) op geprefabriceerde Mini-Protean TGX alle KD-gels (Bio-Rad, Hercules, CA) en overgebracht naar een polyvinylideendifluoridemembraan met behulp van een Trans-Blot Turbo-transfersysteem (Bio-Rad). Immunoblotting werd uitgevoerd volgens het Li-Cor Biosciences (Lincoln, NE) -protocol. In het kort werden niet-specifieke plaatsen geblokkeerd in niet-zoogdierblokkeerbuffer (Li-Cor Biosciences). Na het blokkeren werden de membranen geïncubeerd met primaire antilichamen tegen Beta amyloid 1-16 (6E10, 1: 1.000; Covance); Histone deacetylase sirtuin 1 (SIRT1, 1: 500; Millipore); NAD + glycohydrolase CD38 (CD38; 1: 2.000; R&D, Minneapolis, MN); Dynamine-gerelateerd eiwit 1 (DRP1, 1: 1.000; BD Biosciences, San Jose, CA); Phospho-DRP1 (P616-DRP1, 1: 1.000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA); Mitofusin 2 (MFN2, 1: 1.000; Abcam, Cambridge, MA); Optische atrofie-eiwit (OPA1, 1: 1.000; BD Bioscience); Glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH; 1: 14.000; Cell Signaling Technology); Spanningsafhankelijk anionkanaal (VDAC, 1: 1.000; (konijn); Cell Signaling Technology); VDAC (muis; 1: 1.000; itowetenschappen (Eugene, OR); β- Actin (1: 10.000; Sigma) bij 4 ° C gedurende de nacht. Na 4 x 5 minuten wassen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,1% tween-20 (PBST), werden de membranen 30 minuten in het donker geïncubeerd in het juiste infrarood (IR) fluorofoor geconjugeerd secundair antilichaam (Li-Cor Biosciences). Na PBST-wasbeurten werd het IR-signaal opgevangen op een Odyssey-infraroodbeeldvormingssysteem (Li- Cor Biosciences) en opgeslagen als een digitale afbeelding. VDAC werd gebruikt als laadregeling voor mitochondria en GAPDH of β- Actin voor hersenhomogenaat om een gelijkmatige belasting te garanderen.

 

histologie

Mannelijke en vrouwelijke CaMK2a-mito / eYFP, (3 maanden) werden perfusie-gefixeerd onder diepe anesthesie en vervolgens verwerkt zoals eerder beschreven [26].

 

Laserscannen confocale microscopie en kwantificering van mitochondriale morfologie

Veertig μ m dikke coronale hersenweefselsecties van CaMK2a-mito / eYFP-muizen (3 maanden) werden gewassen met kaliumfosfaatgebufferde zoutoplossing (KPBS) en vervolgens gemonteerd en afgedekt met behulp van Vectashield Hard set (Vector, Burlingame, CA) montagemedia. Mitochondriën in hersendelen van CA1 hippocampale subregio's werden afgebeeld met behulp van een Zeiss LSM 510 laserscanning confocaal

microscoop met een Plan-Apochromat 63x / 1.4 olielens. Enkele vlakken van 1024 × 1024 pixels werden opgenomen bij 1,0 - 1,5 luchtige eenheidspeldengat elke 0,2 μm z-afstand over het gehele weefselgedeelte zoals eerder beschreven [26] met modificaties. In het bijzonder werden z-stapelbeelden verkregen

van het striatum oriens van het CA1-subgebied. Een laser van 488 nm werd gebruikt om eYFP te visualiseren. Vier z-stapel afbeeldingen werden genomen per muisbrein. Opgenomen beelden werden geanalyseerd met Volocity software (Perkin Elmer, Waltham, MA). Kwantificering van mitochondriale morfologie met behulp van

Volocity software werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [26]. De volgende vergelijking werd gebruikt om de 3D-vormfactor (verhouding van het oppervlak van een bol (met hetzelfde volume als het gegeven object) en het oppervlak van het object) te bepalen: V0 = volume van het object;

gihi-nmn

 

statistische analyse

Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelden ± SE, en de vergelijkingen tussen experimentele groepen werden gemaakt met SPSS statistische software (SPSS, Inc., Chicago, IL) met behulp van variantieanalyse (ANOVA). Posthoc Holm-Sidak-methode werd gebruikt voor alle paarsgewijze vergelijkingen na ANOVA-tests.

Student t-test werd gebruikt bij directe analyse van twee groepen (volumegegevens). De betekenis werd aangenomen op p <>

 

resultaten

Exogene NAD + keert deficiënt zuurstofverbruik (OCR) om in een celgebaseerd model van amyloïde beta-toxiciteit N2A hippocampale neuroblastomacellen werden tijdelijk gecotransfecteerd met constructen die mutant APP (swe) / PS1 ( Δ E9) en een tetracycline-transactivator (TTA) bevatten als een op cellen gebaseerd model van effecten van mutante amyloïde toxiciteit. Gecotransfecteerde (getransfecteerde) of TTA-getransfecteerde (controle) N2A-cellen werden voorgeïncubeerd ± nicotinamide adenine dinucleotide (NAD +) en zuurstofverbruiksnelheden (OCR) gemeten. Getransfecteerde N2A-cellen (geen exogene NAD +; blauwe stippellijn) hadden een verlaagde maximale OCR bij blootstelling aan uncoupler carbonylcyanide p- (trifluormethoxy) fenylhydrazon (FCCP) en pyruvaat, vergeleken met controlecellen + NAD + (24% afname; figuur 1, rode vaste stof) lijn); of controlecellen zonder exogene NAD + toevoeging (18% afname; Figuur 1, rode stippellijn). Dit OCR-tekort (figuur 1, blauwe stippellijn) zou kunnen worden verbeterd als exogeen NAD + aanwezig was (27% toename; figuur 1, blauwe ononderbroken lijn). Controle N2A-kweken hadden vergelijkbare OCR ongeacht de toevoeging van NAD + (Figuur 1, rode ononderbroken versus rode stippellijn). Deze experimenten suggereren dat deficiënties in NAD + -niveaus een rol kunnen spelen bij mitochondriale respiratoire disfunctie bij transgene muizen die deze mutatie in vivo tot expressie brengen [14] en kunnen worden gecorrigeerd met toegevoegde NAD +.