Effect van nicotinamide mononucleotide op hersenen mitochondriale respiratoire tekortkomingen bij een relevante ziekte van Alzheimer Murine Model-3

N2A neuroblastoomcelkweekomstandigheden

N2A hippocampale neuroblastomen met lage doorgang (ATCC, Manassas, VA; 5.000 / putje) werden gezaaid op V7-microplaten (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA) in proliferatiemedia ((MEM, (ATCC), 10% foetaal runderserum, (Gibco) , Grand Island, NY), 1% Pen-Strep, (Gibco)) en in een bevochtigde incubator op 37 ° C en 5% CO2 gehouden. Na 24 uur werden de culturen transiënt getransfecteerd (zie hieronder). Na nog eens 24 uur de proliferatiemedia werden vervangen door differentiatiemedia (DM) bestaande uit MEM, 2% paardenserum (Gibco) en 1% Pen-Strep. De culturen hadden mediaveranderingen met behulp van DM 48 uur later en zuurstofverbruiksnelheden werden 24 uur later gemeten. Alle putjes werden kritisch onder de microscoop onderzocht om de levensvatbaarheid van de cellen te verzekeren voorafgaand aan het uitvoeren van experimenten.

Plasmide vectorgeneratie en transfectie

De plasmidevector die cDNA bevat voor een mitochondriaal gericht versterkt geel fluorescerend eiwit (eYFP), mutant APP (swe) en mutant PS1 (ΔE9) beschreven in [14] bezit een tetracycline-reactie-element dat dus co-transfectie met een tetracycline-transactivator (TTA, Clontech) vereist ). Co-transfectie geeft aanleiding tot cellen die eYFP bezitten gericht op mitochondria en van transgene afgeleide APP en PS1. N2A-neuroblastomen werden gecotransfecteerd met beide constructen of alleen TTA (controletransfectie) met behulp van 1 μg DNA / construct / putje met behulp van het Magnetofection-systeem (Oz Biosciences, San Diego, CA) met CombiMag plus lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA) volgens volgens het protocol van de fabrikant.

Isolatie van niet-synaptische mitochondriën in de hersenen

Vierentwintig uur na de laatste NMN of dragerinjecties werden mannelijke en vrouwelijke APP (swe) / PS1 (ΔE9) of niet-transgene muizen (3 maanden) onthoofd, forebrains snel verwijderd en in ijskoude mannitol-sucrose (MS) buffer geplaatst pH 7,4 (225 mM mannitol, 75 mM sucrose, 5 mM Hepes, 1 mg / ml vetzuurvrij BSA (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), 1 mM EGTA). Forebrains werden gehomogeniseerd met 10 slagen met behulp van een Potter-Elvehjem-weefselgrinder (Wheaton Science Products,

Millville, NJ). De hersenhomogenaten werden verder verwerkt met behulp van de Percoll-isolatiemethode beschreven door [22] en zoals eerder gebruikt [14,23]. Van deze methode is aangetoond dat deze een hoge mate van mitochondriale zuiverheid vertoont door elektronenmicroscopie [23]. Eiwitconcentraties werden bepaald met de methode beschreven door [24] met behulp van BSA als normen. Aan porties van mitochondria en homogenaat van de hersenen werden proteaseremmers (Calbiochem, San Diego, CA) toegevoegd voorafgaand aan opslag bij -20 ° C voor latere Western-blotanalyses.

N2A neuroblastoma cel respirometrie

Voorafgaand aan metingen werden kweken voorzichtig gespoeld in voorverwarmde (37 ° C) assay-meetbuffer (MB) bestaande uit 120 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 1,3 mM CaCl2, 0,4 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES (pH 7.4) aangevuld met 2,5 mM D-glucose. De cellen werden vervolgens gedurende 2 uur in een ongebufferde, bevochtigde incubator bij 37 ° C geplaatst om evenwicht van temperatuur en pH mogelijk te maken. Cellen werden visueel geïnspecteerd vóór en na toevoeging van MB en vervolgens op de Seahorse XF24-3 fluxanalysator (Seahorse Bioscience) geladen. Na een equilibratiestap werden basale zuurstofverbruiksnelheden (OCR, pMoles / min) opgenomen met behulp van 3-minuten mix, 2-minuten wachten en 3-minuten meten (driemaal lus) cycli voorafgaand aan injectie van oligomycine om de ATP-synthase te remmen . Nog drie meetlussen werden opgenomen voorafgaand aan injectie van carbonylcyanide p- (trifluormethoxy) fenylhydrazon (FCCP) om maximaal zuurstofverbruik te induceren. Na opname van nog 3 meetlussen werd pyruvaat geïnjecteerd om te bepalen of het maximale zuurstofverbruik na FCCP-toevoeging substraatbeperkend was. Antimycine A (remmer van mitochondriale ademhaling) werd geïnjecteerd na 3 meetlussen om niet-mitochondriale OCR te beoordelen. Twee meetlussen werden opgenomen na injectie met antimycine A, waarna het experiment werd beëindigd. De in MB bereide injectaten (75 μl volumes) werden vooraf geladen en vervolgens achtereenvolgens geïnjecteerd zoals aangegeven door poorten in de XF24-kalibratiecartridge tot eindconcentraties van 1 μg / ml oligomycine, 1 μM FCCP, 10 mM pyruvaat en 1 μM antimycine A. Elk plaat had een subset van cellen geïncubeerd met 10 mM nicotinamide adenine dinucleotide (NAD +, tijdens de DM-pre-incubatie) voorafgaand aan metingen.

Hersen mitochondriale respirometrie

Na kalibratie van de Seahorse XF24-3-fluxanalysator (Seahorse Bioscience) werden de uiteindelijke niet-synaptische mitochondriale pellets van individuele muizenhersenen geresuspendeerd in MAS1-buffer [25] en 5 μg eiwit zoals hierboven bepaald [24] geladen in elk van de 20 putjes van een XF24 V7-celcultuurplaat (Seahorse Bioscience). De platen werden 5 minuten gecentrifugeerd bij 1600 x g bij 4 ° C. MAS1-buffer met 5 mM L-malaat plus 5 mM natriumpyruvaat (vers gemaakt in MAS1-buffer) werd voorzichtig aan de putjes toegevoegd en de platen werden onmiddellijk op het instrument geladen en zuurstofverbruikmetingen werden geregistreerd zoals eerder beschreven [14]. Alle metingen werden uitgevoerd bij 37 ° C.