NAD + Omzet in skeletspier wordt voornamelijk gereguleerd door NAMPT Salvage van NAM, maar NR bewijst een waardevollere voorloper voor het vergroten van NAD +

NAD + omzet in skeletspier wordt voornamelijk gereguleerd door NAMPT redding van NAM, maar NR bewijst een waardevollere voorloper voor het vergroten van NAD +

Omdat de NA Preiss-Handler-route meestal beperkt is tot NAD + biosynthese in de lever en NA-behandeling beperkt is vanwege bijwerkingen, hebben we ons gericht op het vaststellen van de NAD + -precursors en de routes die kunnen worden gebruikt om het NAD + -gehalte in skeletspier te verbeteren [15,34] . Gegevens van metabole enzymactiviteitprofilering suggereren dat de geamideerde routes naar NAD +, gemedieerd door de NAMPT- en NRK-bergingsroutes, prevaleren als de belangrijkste biosynthetische routes naar NAD + in spieren, die wordt bevestigd door onze weefselexpressiegegevens en moleculaire analyse [34]. Om dit verder te beoordelen, hebben we primaire afgeleide myotubes aangevuld met NAD + -precursors die kunnen worden gebruikt door NRK- of NAMPT-routes; NAR (niet-geamideerde versie van NR), NR, NMN en NAM (Figuur 1A) en gekwantificeerde NAD + met behulp van een cyclische test. NAR wordt, net als NR, gemetaboliseerd door NRK's tot NAMN en vervolgens tot NAAD door NMNAT's [40]. NAAD vereist echter laatste amidatie tot NAD + via NAD-synthetase [41]. We vonden dat NAR de NAD + -pool in spiercellen niet kon vergroten, terwijl zowel NR- als NMN-suppletie de NAD + in myotubes met bijna een factor 2 aanzienlijk verhoogde. Equivalente NAM-concentraties verhoogden echter niet significant NAD +, met een 10-voudige overmaat NAM vereist om NAD + te verhogen (Figuur 3A). NAMPT wordt beschouwd als de snelheidsbeperkende stap voor NAD + berging en synthese in skeletspier [38] maar is niet in detail onderzocht in de context van NRK's. We onderzochten voorloperberging en NAD + -niveaus in myotubes behandeld met de krachtige NAMPT-remmer FK866 [42]. NAMPT is inderdaad essentieel voor basale NAD + homeostase met NAD + niveaus ernstig uitgeput (met meer dan 70%) na 24 uur remming. Deze uitputting werd volledig omgekeerd door NR- en NMN-suppletie, en beide voorlopers waren nog steeds in staat om NAD + in dezelfde mate te stimuleren als zonder behandeling met FK866, hetgeen bevestigde dat NR en NMN-berging onafhankelijk is van NAMPT (Figuur 3B). Om meer inzicht te krijgen in de activiteit van NR, gebruikten we LC-MS-gebaseerde gerichte kwantitatieve metabolomics. Tabel 1 toont niveaus van belangrijke NAD + metabolieten in primaire myotubes behandeld met FK866 en NR. Zoals verwacht, nemen de NAD (H) -niveaus aanzienlijk toe na NR-suppletie, en belangrijker is dat we hier een grote toename in cellulaire NR en NMN identificeren uit controlecellen 24 uur na celbehandelingen. Interessant is dat metabolieten van NAD + -consumptie, NAM en ADP-ribose (ADPr) niet werden veranderd door NR-behandeling, maar niveaus werden verlaagd na FK866-geïnduceerde NAD + uitputting, wat suggereert dat NAD + beschikbaarheid alleen snelheidsbeperkend is voor NAD + signalering onder normale niveaus (tabel 1). NA en andere metabolieten van de Preiss-Handler en de novo NAD + biosynthese-routes werden niet gedetecteerd in primaire myotubes. NAD + is van vitaal belang voor mitochondriale ademhaling, dus we hebben het belang aangetoond van NAMPT voor het handhaven van NAD + omzet door C2C12 myotubes gedurende 72 uur te behandelen met FK866. Remming van NAMPT verminderde significant de basale en maximale ademhaling, die volledig werd gered door behandeling met NR gedurende de laatste 24 uur (Figuur 3C). NR alleen verhoogde de mitochondriale ademhaling niet boven onbehandelde niveaus (Figuur 3C). Concordant werd apoptose gestimuleerd in C2C12-myotubes na 48e 72 uur NAMPT-remming. Suppletie met NR heeft dit effect volledig voorkomen (Sup. 1B). Het is bekend dat veranderingen in NAD + beschikbaarheid en spiercel-energetica als gevolg van NAMPT-remming verhoogde snelheden van NAMPT-gentranscriptie door AMPK-activiteit stimuleren; de effecten op NRK's in dit verband zijn echter onbekend [43,44]. Met behulp van real-time PCR laten we zien dat cellulaire mRNA-expressie van NAD + bergingsgenen nauw wordt gereguleerd door NAD + beschikbaarheid. NAD + uitputting door FK866 resulteerde in opregulering van Nmrk2 en Nampt en neerregulering van Nmrk1 (Figuur 3D). Repletie van NAD + door NR-suppletie bracht mRNA-niveaus van alle genen terug naar die van onbehandelde controle en met NR behandelde cellen (Figuur 3D). Deze gegevens tonen aan dat NAMPT cruciaal is voor basale NAD + biosynthese. NR-suppletie kan NAMPT-remming volledig redden door NRK-gemedieerde NAD + berging. Deze gegevens suggereren dat NRK-activiteit onafhankelijk in staat is cellulair NAD + te handhaven en dat NR-beschikbaarheid NRK-activiteit onder basale omstandigheden kan beperken.