Nicotinamide Riboside, een vorm van vitamine B3, beschermt tegen door excitotoxiciteit geïnduceerde axonale degeneratie-2

MATERIALEN EN METHODES

Productie van microfluïdische chips

De chipmaster met 3 compartimenten werd gebouwd zoals beschreven in Kanaan et al. (37). Voor chipproductie werd polydimethylsiloxaan (Sylgard 184, PDMS; Dow Corning, Midland, MI, VS) gemengd met een verharder (verhouding 9: 1) en ontgast onder vacuüm. Het resulterende preparaat werd op een polyesterharsreplicaat gegoten en gedurende ten minste 2 uur bij 70 ° C gereticuleerd. De elastomere polymeerprint werd losgemaakt en 2 reservoirs werden geponst voor elk macrokanaal. De polymeerprint en een glazen dekglaasje, gereinigd met isopropanol en gedroogd, werden gedurende 3 minuten behandeld in een luchtplasmagenerator (98% vermogen, 0,6 mbar; Diener Electronic, Ebhausen, Duitsland) en aan elkaar gehecht. De chips werden gedurende 20 minuten onder UVV geplaatst en vervolgens gecoat met een oplossing van poly D-lysine (10 mg / ml, P7280; Millipore-Sigma, St. Louis, MO, VS) gedurende de nacht en gewassen met Dulbecco-PBS (D-PBS) (14190169 ; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS) vóór celzaaien. Als alternatief kan chips met 3 compartimenten worden gekocht van Microbrain Biotech (Parijs, Frankrijk).

Primaire neuronale cultuur

Alle dieren werden ethisch onderhouden en gebruikt in overeenstemming met het Europese beleid inzake ethiek. Cortices werden micro-gedissecteerd van E14-embryo's van Zwitserse muizen (Janvier, Le Genest Saint Isle, Frankrijk) in D-PBS aangevuld met 0,1% (w / v) glucose (Thermo Fisher Scientific). C57BL / 6Nmicewew werden gebruikt in Nmrk2-knockout (KO) -experimenten. Ontlede structuren werden gedigereerd met papaïne (15 U / ml in DMEM; 76220; Millipore-Sigma) gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Na inactivering van papaïne met 10% (v / v) foetaal runderserum (GE Healthcare, Little Chalfont, Verenigd Koninkrijk),

structuren werden mechanisch gedissocieerd met een pipet in DMEM Glutamax-1 (31966; Thermo Fisher Scientific) met DNAse-I (D5025, Millipore-Sigma). Na 27 min centrifugaties bij 700 g werden cellen geresuspendeerd in amedium met DMEM Glutamax-1, penicilline (100 U / ml) / streptomycine (100 mg / ml) (15140; Thermo Fisher Scientific), 5% (v / v) foetaal runderserum,

N2-supplement (17502048; Thermo Fisher Scientific) en B-27-supplement (17504-044; Thermo Fisher Scientific) tot een uiteindelijke dichtheid van 50 miljoen cellen / ml. Corticale cellen werden vervolgens gezaaid in de

somatisch compartiment. Celkweekmedium werd gelijk toegevoegd aan de 4 reservoirs. Microfluïdische chips werden in petrischalen geplaatst die 10% EDTA (Millipore-Sigma) bevatten en geïncubeerd bij 37 ° C

in een 5% CO2-atmosfeer. Het kweekmedium werd om de 6 dagen vernieuwd. Na differentiatie kwamen corticale axonen de microkanalen binnen en bereikten de tweede kamers na 4-5 d.

Corticale axonen bleven daarna groeien Nmrk2-KO muis Nmrk2-KO muizen werden verkregen door injectie van embryonale stamcellen (Nmrk2tm1 (KOMP) Vlcg allel) van de KnockoutMouse

Project (KOMP) in C57BL / 6N blastocysten in Centre National de la Recherche Scientifique – Transgenese, archivering en diermodellen (CNRS – TAAM) Transgene dierenfaciliteit

(SEAT; Villejuif, Frankrijk). Alle exons en introns van het NMR2-gen worden vervangen door een lacZ-reportergen om een nul-allel in embryonale stamcellen te creëren (University of California, Davis, Davis, CA,

VERENIGDE STATEN VAN AMERIKA; https://www.komp.org/geneinfo.php?geneid=65082). Chimere mannelijke muizen werden gebruikt om heterozygote Nmrk2-mutante muizen op een C57BL / 6N-achtergrond te verkrijgen. Homozygoot Nmrk2-Ko micrewoonbaar en vruchtbaar. We valideerden de deletie door het genomische DNA van de KO-muizen te sequencen.