Nicotinamide Riboside, een vorm van vitamine B3, beschermt tegen door excitotoxiciteit geïnduceerde axonale degeneratie-3

Farmacologische behandelingen

Cellen werden voorbehandeld en / of behandeld tussen 11 en 13d in vitro. Om vloeistofisolatie te verzekeren, werd een differentiële hydrostatische druk tussen compartimenten gehandhaafd.

De volgende verbindingen werden gebruikt: NMDA, (100 mM; M3262; Millipore-Sigma), FK866 (10 mM; F8557; Millipore-Sigma), NAD + (N3014; Millipore-Sigma), NMN (N3501; Millipore-Sigma), NR (ChromaDex, Irvine, CA, VS), NAM (N0636; Millipore-Sigma), dipyridamol (DP, 50 mM; D9766; Millipore-Sigma), cytidine-monofosfaat (CMP; 25 mM; C1006; Millipore-Sigma), en ( +) MK-801-maleaat (10/50 mM; 0924; Tocris Bioscience, Bristol, Verenigd Koninkrijk).

Immunofluorescentiedetectie en beeldverwerving

Op verschillende tijdstippen werden kweken gefixeerd met 4% (w / v) paraformaldehyde (15714-S; Euromedex, Souffelweyersheim, Frankrijk) + 4% (w / v) sucrose (S0389; Millipore-Sigma) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Cellen werden vervolgens eenmaal 10 minuten gewassen met PBS en 30 minuten gepermeabiliseerd met D-PBS met 0,2% (v / v) TritonX-100 (Millipore-Sigma) en 1% (w / v) BSA (Millipore-Sigma). Immunokleuring werd uitgevoerd zoals beschreven in Magnifico et al. (6) met behulp van de volgende geconjugeerde antilichamen verdund in D-PBS: anti-bIII tubuline-Alexa Fluor 488 (1: 500, AB15708A4; Millipore-Sigma) en anti-microtubuleassociated proteïne 2 (MAP2) -Alexa 555 (1: 500, MAB3418A5; Millipore-Sigma). Celkernen werden gekleurd met behulp van Hoechst 33342 (2 mg / ml). De chips werden vervolgens eenmaal gespoeld met PBS en gevuld met PBS + 0,1% natriumazide. Beelden werden verkregen met een Axio-waarnemer Z1-microscoop (Zeiss, Wetzlar, Duitsland) uitgerust met een gekoelde CCD-camera (CoolsnapHQ2; Roper Scientific, Trenton, NJ, VS). De microscoop werd bestuurd met Metamorph (Berlijn, Duitsland) software en beelden werden geanalyseerd met ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, VS).

 

Kwantificering van axonale fragmentatie en neuronale dood

Axonale fragmentatie werd beoordeeld met een macro ontwikkeld in ImageJ-software die de volgende stappen bevatte: 1) achtergrond aftrekken, 2) plug in tubeness (s = 1), 3) plug in Otsu- drempellaag,

en 4) deeltjes analyseren door het totale deeltjesoppervlak (ATOTAL) te meten en deeltjes met een cirkelvormigheid groter dan 0,2 (A0.2) te identificeren. De fragmentatie-index wordt verkregen als de verhouding A0.2 / ATOTAL. Deze index is bijna lineair gecorreleerd met gefragmenteerde axonpercentages: indices onder 0,2, 0,5 en maximaal 0,8 komen overeen met respectievelijk 10, 50 en meer dan 90% van gefragmenteerde axonen. Neuronale dood werd gekwantificeerd door de verhouding van condenserende kernen tot totale kernen te berekenen.