Nicotinamide Riboside, een vorm van vitamine B3, beschermt tegen door excitotoxiciteit geïnduceerde axonale degeneratie-4

PCR en real-time kwantitatieve PCR

Primaire corticale neuronen werden gelyseerd op DIV 11 en weefsels werden gelyseerd van muizen van 8 weken oud. Drie putjes werden samengevoegd om 1 monster te verkrijgen. Totaal RNA werd geïsoleerd met een RNeasy-kit (74104; Qiagen, Valencia, CA, VS) volgens het protocol van de fabrikant. Van het totale RNA werd 1 mg behandeld met RNase free-Dnase en opnieuw getranscribeerd met een SuperScript II reverse transcriptase-kit (18064-022; Thermo Fisher Scientific) volgens de instructies van de fabrikant. Het resterende RNA werd gehydrolyseerd met behulp van RNase H van E. coli (AM2293; Thermo Fisher Scientific).

PCR-amplificatie werd uitgevoerd in een thermocycler door 2 ml cDNA te mengen met 0,5 mM voorwaartse en achterwaartse nucleotidesequenties (tabel 1) in een PCR-buffer met dNTP-mengsel (elk 200 mM), MgCl2 (1,5 mM) en 0,5 U Taq DNA-polymerase (18038; Thermo Fisher Scientific). Aanvankelijk werd het sjabloon gedenatureerd door 5 minuten te verwarmen tot 95 ° C, gevolgd door 30 amplificatiecycli. Elke cyclus bestond uit 3 stappen: de eerste gedurende 45 sec bij 94 ° C, de tweede gedurende 30 sec bij gloeitemperatuur (afhankelijk van het versterkte mRNA) ) en de derde gedurende 1 minuut bij 72 ° C voor polymerisatie. De laatste stap was een verlenging bij 72 ° C gedurende 10 minuten. PCR-producten werden geëlektroforeerd op 1,5% (w / v) agarosegel en gekleurd met ethidiumbromide (0,5 mg / ml).

Kwantitatieve PCR werd uitgevoerd met een LightCycler480 (Roche Applied Science, Penzberg, Duitsland), door 1:50 verdunde cDNA te mengen met de doelspecifieke primers en Light Cycler 480 SYBRGreen I Master mix (4707516001; Roche, Basel, Zwitserland) volgens de gebruiksaanwijzing. Amplificatie-omstandigheden waren initiële denaturatie gedurende 5 minuten bij 95 ° C

gevolgd door 40 cycli van 10 sec bij 95 ° C, 15 sec bij gloeitemperatuur en 10 sec bij 72 ° C. De resultaten zijn geanalyseerd met LightCycler 480 SW 1.5-software. Individuele PCR-producten werden geanalyseerd door

smeltpuntanalyse. Het expressieniveau van een gen was genormaliseerd ten opzichte van dat van muizen-b-actine of hypoxanthineguanine fosforibosyltransferase (HPRT).


NAD + test

NAD + werd gemeten met behulp van EnzyChrom NAD + / NADH Assay Kit (E2ND-100; Euromedex) volgens het protocol van de fabrikant. Gerichte kwantitatieve NAD + metabolomics werden uitgevoerd zoals beschreven in Trammell en Brenner (38).


In vivo NMDA-geïnduceerde excitotoxiciteitsexperimenten

Experimenten werden uitgevoerd op mannelijke C57 / BL6-muizen (23 6 3 g, geproduceerd en geleverd door GIP Cyc´eron-dierfaciliteiten) in overeenstemming met EU-richtlijnen (210/63 / UE) en Franse ethische wetten (R214; 87-137; Minist`ere de l'Agriculture) over dierproeven en zijn goedgekeurd door het Universit´e Caen Normandie Animal Welfare Committee. Muizen werden diep verdoofd met isofluraan 5% en onder narcose gehouden met 2% isofluraan in een 70/30% gasmengsel (N2O / O2) tijdens chirurgie. De rectale temperatuur werd gehandhaafd op 37 60,5 ° C gedurende de chirurgische procedure met behulp van een feedbackgereguleerd verwarmingssysteem.

Een corticale unilaterale injectie [coördinaten: 0,5 mm posterieur, 2,0 mm lateraal, 20,5 mm ventraal ten opzichte van het bregma (39)] van NMDA (5 nmol; in 0,33 ml), al dan niet geïnjecteerd met NAD + of NR (50 nmol)

werd uitgevoerd na het plaatsen van de dieren in een stereotaxisch kader.

Oplossingen werden geïnjecteerd door het gebruik van een micropipet gemaakt met hematologicmicropipetten (gekalibreerd op 15 mm / ml, assistent ref 555/5; Hecht, Sondheim-Rhoen, Duitsland). De micropipet werd 3 minuten later verwijderd. Het volume van de laesie werd 48 uur later geanalyseerd.


MRI

Experimenten werden uitgevoerd op een Pharmascan 7T (Bruker, Bremen, Duitsland). T2-gewogen beelden werden verkregen met een multi-plak multiecho-sequentie: TE / TR 51.3 / 2500 ms 48 uur na injectie. Volumes van laesies werden gekwantificeerd op MRI met ImageJ software.


statistische analyse

Verschillen werden beoordeeld door een Mann-WhitneyUtest om 2 condities te vergelijken of een Kruskal-Wallis-test om> 2 condities te vergelijken.