Nicotinamide Riboside, een vorm van vitamine B3, beschermt tegen door excitotoxiciteit geïnduceerde axonale degeneratie-7

NR wordt omgezet in NAD + in corticale neuronen

Niet alle modellen van WldS-afhankelijke neuroprotectie roepen een vereiste op voor NAD + biosynthese (42). Dienovereenkomstig hebben we de hypothese getest dat het beschermende effect van NR afhangt van zijn intracellulaire conversie naar NAD + (Fig. 4A). Eerst vroegen we of NR corticale neuronen binnengaat voor verdere conversie naar NAD +. NR is een nucleoside waarvan wordt gemeld dat het plasmamembranen door NT kruist (25, 27). Onder NT-isovormen, expressieanalyse in ons neuronale celkweekmodel gaf aan dat alle equilibratieve nucleosidetransporter (ENT1-4) transcriptworden tot expressie gebracht (Fig.4B). Geen van de concentratieve nucleosidetransporter (CNT1-3) mRNA's kon echter worden gedetecteerd. DP, een krachtige farmacologische remmer van EN1- en-2-activiteiten, blokkeert NR-celinvoer in menselijke cellijnen (25, 43). Cotreatment van corticale neuronen met 100 mMNMDA, 1 mMNR en 50 mMDP voorkwam vrijwel volledig NR-geïnduceerde axonale bescherming (axonale bescherming nam af met 68%; van 88 tot 20%), waarbij werd vastgesteld dat het neuroprotectieve effect van NR DP-gevoelig transport door het plasma vereist membraan (Fig. 4C).


Intracellulaire NR-conversie naar NAD + wordt geïnitieerd door Nmrk1 / 2, die de NAD + -proximale voorloper, NMN (Fig.4A) genereert. Gesanalytiseerde NMr1 en -2mRNA-expressie door kwantitatieve RT-PCR van zowel specifieke muizenhersengebieden als van corticale neuronen in kweek. We ontdekten dat Nmrkl mRNA constitutief tot expressie wordt gebracht in alle weefsels, terwijl Nmrk2 mRNA afwezig was in alle hersengebieden (cortex, hippocampus en cerebellum) (Fig. 4D, E). Nmrk2-transcript werd echter sterk tot expressie gebracht in hart en dwarsgestreepte skeletspieren, zoals eerder beschreven (30, 44). Nmrk1 maar niet Nmrk2 mRNA werd ook tot expressie gebracht in gekweekte corticale neuronen (Fig. 4E). Nmrk2-mRNA werd gemeld te worden geïnduceerd in PNS-neuronen na heupzenuwaxotomie (7). Om een mogelijke inductie van Nmrk2 na een excitotoxische insult in corticale neuronen te onderzoeken, werd Nmrk2mRNA gekwantificeerd na 100 mMNMDA-behandeling gedurende 24 uur. We vonden een lage inductie van Nmrk2-transcript, maar een 4-voudige toename van Nmrk1-mRNA. NR-kinase-activiteit leidt tot vorming van NMN, dat via Nmnat-enzymen adenylyleert tot NAD +. We analyseerden Nmnat1-3 mRNA-expressie in corticale neuronen die al dan niet met NMDA 100 mM werden behandeld gedurende 3 of 24 uur. We toonden aan dat alle transcripten tot expressie worden gebracht, met het hoogste niveau voor de cytosolische isovorm Nmnat2, gevolgd door het mitochondriale enzym Nmnat3 (aanvullende Fig. S2A). Elk van de mRNA's werd geïnduceerd door 24-uurs NMDA-behandeling zodat alle componenten van de NR-kinaseroute naar NAD + biosynthese werden opgereguleerd tijdens neuronale belediging. NR-omzetting in NAD + kan worden geïnitieerd door nucleosidefosforylase, dat NR omzet in NAM, dat verder wordt omgezet in NAD + (45). Gelijktijdige behandeling van corticale neuronen met NMDA 100 mM en NAM 5 mM gedurende 24 uur toonde echter aan dat NAM niet in staat is om door NMDA geïnduceerde AxD te voorkomen (aanvullend Fig. S2B). Vervolgens hebben we NAD + -niveaus in neuronen geëvalueerd tijdens een excitotoxische uitdaging. Behandeling van corticale neuronen met 100 mM NMDA gedurende 24 uur induceerde een afname van 36% in intracellulaire NAD +. Dit effect werd teruggedraaid door co-behandeling met 1 mM NR (Fig. 4F). Samen bevestigen deze resultaten dat conversie van NR naar intracellulair NAD + via de transcriptioneel geïnduceerde NR-kinase oppositie tegen door excitotoxiciteit geïnduceerde AxD.


NR

Figuur 3. Het NR-beschermende effect is hoofdzakelijk beperkt tot het axonale compartiment. A – E) Fluorescentiemicroscopische analyse van de somatische status en AxD na blootstelling van corticale neuronen aan 100 mM NMDA en 1 mM NR. Elke molecuulbehandeling werd 24 uur toegevoegd. Links: het somatische compartiment gekleurd met Hoechst 33342; rechts: het axonale compartiment gekleurd met anti-b3-tubuline. Regelconditie (ø / ø) (A); somatische NMDA-behandeling (NMDA / ø) (B); somatische NMDA-NR-co-behandeling en axonale NR-behandeling (NR-NMDA / NR) (C); somatische NR-NMDA-co-behandeling (NR-NMDA / ø) (D); en somatische NMDA-behandeling en axonale NR-behandeling (NMDA / NR) (E). Weegschalen, 20 mm. F, G) Kwantificering van AxD na 100 mM NMDA-behandeling en totale, proximale of distale 1 mM NR-behandeling (F) of 5 mM NAD + -behandeling (G) (n = 3). * P, 0,05.

nr-2


Figuur 4. Extracellulaire NR wordt getransporteerd door het plasmamembraan voor een neuroprotectief effect en wordt gemetaboliseerd tot intracellulair NAD +. A) Schematische weergave van NR-metabolisme in cellen: NR komt de cel binnen via CNT's of ENT's en wordt gemetaboliseerd tot NAD + via NR-kinase 1/2 (Nmrk1 / 2) en Nmnat. B) mRNA-niveau van ENT 1-4 genormaliseerd naar HPRT-transcript in corticale neuronen. C) DP keerde het axon-beschermende effect van NR terug in neuronen behandeld met NMDA. Kwantificering van AxD na 100 mM NMDA-behandeling, met of zonder 1 mM NR en 50 mM DP gedurende 24 uur (n = 4). D) Nmrkl mRNA wordt constitutief tot expressie gebracht, terwijl Nmrk2 mRNA niet detecteerbaar is in hersenweefsels. Nmrk1- en Nmrk2-mRNA-niveau in hersenweefsels (cortex, hippocampus en cerebellum), hart, skeletspieren en lever genormaliseerd naar b-actinetranscript. E) NMDA-behandeling induceert Nmrk1 maar geen Nmrk2-transcript. mRNA-niveaus werden geanalyseerd met real-time kwantitatieve PCR 3 en 24 uur na 100 mM NMDA-behandeling en genormaliseerd op HPRT-transcript (n = 3). F) NR-behandeling herstelt NMDA-geïnduceerde NAD + uitputting. Het NAD + -niveau werd gemeten in corticale neuronen gekweekt op platen en blootgesteld aan 100 mM NMDA, met of zonder 1 mM NR gedurende 24 uur (n = 4). * P, 0,05, ** P, 0,01, *** P, 0,001.