Nicotinamide Riboside, een vorm van vitamine B3, beschermt tegen door excitotoxiciteit geïnduceerde axonale degeneratie-5

RESULTATEN

NMDA-behandeling op neuronale cellichamen induceert neuronale dood en axonale degeneratie

Om de beschermende effecten van NAD + en NR op AxD te ontleden, hebben we corticale neuronen gekweekt in microfluïdische apparaten met 3 kamers die met elkaar zijn verbonden (37). Toen ze in de linkerkamer werden gezaaid, projecteerden corticale neuronen hun axonen vanuit de proximale naar de distale kamer door asymmetrische filterende microkanalen, terwijl de somata en dendrieten waren opgesloten in de linkerkamer. Als gevolg van een dergelijke compartimentering bevatte de rechter kamer van het microfluïde apparaat alleen axonen. Bij drukloze druk fungeert de centrale kamer als sifon en zorgt voor een optimale vloeistofisolatie van de distale axonale en somatodendritische kamers (Fig. 1A, B). Analyse van dendrieten (MAP2, rood), nucleair chromatine (Hoechst 33342, blauw) en axonen (b3-tubuline) gaven aan dat de uitgezaaide corticale neuronen gezond waren na 2 weken in cultuur (Fig. 1C). Somatodendritische toediening van 100 mM NMDA in de proximale kamer veroorzaakte dendrietdegeneratie gekenmerkt door een verlies van MAP2-immunokleuring en nucleaire condensatie geassocieerd met een ernstige AxD gevisualiseerd door punctiforme b3-tubuline-immunokleuring in de distale kamer (Fig. 1C – G). Daarentegen had lokale toepassing van NMDA op axonen in de distale kamer geen effect op neuronen, consistent met het feit dat NMDA-receptoren (NMDAR's) uitsluitend gelokaliseerd zijn in het somatodendritische compartiment (22) (Fig. 1E – G). NMDAR-betrokkenheid bij door NMDA geïnduceerde neurodegeneratie werd bevestigd met de niet-competitieve NMDAR-antagonist MK-801. Nucleaire condensatie en AxD na 8 uur NMDA-behandeling werden volledig geblokkeerd door co-toevoeging van 10 of 50 mM MK-801 (Fig. 1H, I).


NR heeft een sterker neuroprotectief effect dan NAD + tijdens excitotoxiciteit, zowel in vitro als in vivo

Om de potentiële neurobeschermende eigenschappen van NAD + en NR te evalueren en te vergelijken, werden corticale neuronen behandeld met 100 mMNMDA in de aanwezigheid of afwezigheid van 5 mM NAD + of 1 mMNR. Nucleaire condensatie en AxD werden vervolgens in de tijd gekwantificeerd. Zoals getoond in Fig. 2A werd na 24 uur behandeling geen remming van dendrietdegeneratie (MAP2) noch remming van nucleaire condensatie waargenomen na behandeling met NAD + of NR, terwijl beide moleculen AxD vertraagden (Fig. 2A - C). NAD + -bescherming was zwak (67% van bescherming vergeleken met NMDA-effect na 8 uur behandeling, 22% na 24 uur), terwijl NR volledig axonen beschermde na 8 uur en nog steeds 72% bescherming bood 24 uur na NMDA-behandeling (fig. 2C) . NAD + en NR-efficiëntie werden ook vergeleken in een dosisbereikassay in corticale neuronen die gedurende 24 uur met 100 mM NMDA waren behandeld (Fig. 2D).


NAD + begon AxD uit te stellen van 5 mM. NR was daarentegen efficiënt bij een 10-voudige lagere dosis (0,5 mM; 33 versus 43% van de bescherming) met een maximale beschermende activiteit bij 1 mM. We vroegen of de afwezigheid van bescherming van NAD + en NR op door NMDA geïnduceerde nucleaire condensatie te wijten was aan de hoge dosis NMDA (100 mM) die leidde tot onherstelbare degeneratie. Dienovereenkomstig daagden we 5 mM NAD + of 1 mM NR uit met een lagere 10 mM NMDA-concentratie gedurende 24 uur (aanvullende Fig. S1). Een lagere nucleaire condensatie werd waargenomen met 10 mM NMDA (30%) vergeleken met die verkregen met 100 mM NMDA (53%) maar noch NAD + noch NR hadden enig beschermend effect op dit fenomeen.


Gezien de verschillende neuroprotectieve activiteiten van NAD + en NR in ons in vitro model van excitotoxiciteit, vroegen we of NAD + en NR neuroprotectief zouden kunnen zijn in een in vivo setting van excitotoxiciteit. Voor dit doel hebben we NMDA (5 nmol) en NAD + of NR (elk 50 nmol) ingebracht in corticale structuren zoals gepubliceerd (40). Opvallend was dat het volume van de door NMDA geïnduceerde laesie zoals gemeten met MRI aanzienlijk was verminderd na NR-muntuitstoot, terwijl NAD + geen significante bescherming vertoonde (Fig. 2E, F). NR heeft dus een krachtiger neuroprotectief effect dan NAD + bij NMDA-geïnduceerde neurodegeneratie, zowel in vitro als in vivo.

Nicotinamide Riboside

Figuur 1. Somatische toepassing van NMDA op corticale neuronen induceert neuronale dood en axonale degeneratie. A) 3-dimensionale weergave van microfluïde apparaten bestaande uit 3 gescheiden kamers verbonden door trechtervormige microkanalen. Corticale neuronen worden in de proximale kamer gezaaid en axonen bereiken de distale kamer na 4-6 dagen in vitro. Een overdruk centraal kanaal maakt optimale vloeistofisolatie en gecompartimenteerde behandeling tussen somatische en axonale compartimenten mogelijk. B) Lichtmicroscoopbeeld van microkanalen tussen proximale en distale kamers. C – E) Representatieve microfoto's van somatische en axonale compartimenten na NMDA-behandeling. Corticale neuronen werden 11 dagen gekweekt en 24 uur behandeld met 100 mM NMDA. Links: het somatodendritische compartiment gekleurd met anti-MAP2 (rood) en Hoechst 33342 (blauw). Sterretjes geven gecondenseerde kernen aan. Rechts: het axonale compartiment gekleurd met anti-b3-tubuline: controletoestand (ø / ø) (C); somatodendritische behandeling met NMDA (NMDA / ø) (D); en selectieve axonale behandeling met NMDA (ø / NMDA) (E). Weegschalen, 20 mm. F) Kwantificering van nucleaire condensatie bij controle en na gecompartimenteerde NMDA-behandeling. Gecondenseerde kernen werden geteld na Hoechst-kleuring (n = 3). G) Kwantificering van AxD in controle en na gecompartimenteerde NMDA-behandeling (n = 3). Axonale fragmentatie-index werd berekend zoals beschreven in Methoden. H, I) Effect van de NMDA-antagonist MK-801 op door NMDA geïnduceerde nucleaire pyknosis en AxD: cellen werden gelijktijdig behandeld met 100 mM NMDA en 10/50 mM MK-801 in het somatodendritische compartiment. Kwantificering van somatische status (H) en AxD (I) (n = 3). * P, 0,05.