Verband tussen seminale plasmaspiegels van anandamide

Verband tussen seminale plasmaspiegels van anandamide-congeneren palmitoylethanolamide en oleoylethanolamide en spermakwaliteit

Akwasi Atakora Amoako, B.Sc., MB, Ch.B., MRCOG, Ph.D., een Timothy Hywel Marczylo, Ph.D., b Janine Elson, MD, FRCOG, c Anthony Henry Taylor, Ph.D. , een Jonathon M. Willets, Ph.D., a en Justin Chi Konje, MD, FRCOG a

een Endocannabinoid Research Group, sectie Reproductive Science, Afdeling Cancer Studies and Molecular Medicine, University of Leicester, Leicester; b Centrum voor stralings-, chemische en milieurisico's, Health Protection Agency, Didcot, Oxfordshire; en c London Women's Clinic, Londen, Verenigd Koninkrijk

Doel: Bepalen of veranderingen in de seminale plasmaconcentraties van de endogene lipidesignaleringsmoleculen palmitoyle-thanolamide (PEA) en oleoylethanolamide (OEA) significante effecten hebben op de spermakwaliteit.

Ontwerp: biochemische en fysiologische studies van menselijk seminaal plasma en spermatozoa.

Omgeving: Academisch ziekenhuis voor tertiaire verzorging.

Patiënt (en): negentig mannen die naar een kliniek met onvruchtbaarheid voor sperma-analyse gaan.

Interventie (s): Palmitoylethanolamide en OEA geëxtraheerd uit seminaal plasma werden gekwantificeerd met ultra high-performance liquid chromatography (HPLC) -tandem massaspectrometrie. Patiënten sperma van sperma met normale parameters werden in vitro blootgesteld aan PEA of OEA om de effecten op beweeglijkheid, levensvatbaarheid en mitochondriale activiteit van het sperma te bepalen.

Belangrijkste uitkomstmaatstaf (en): de relatie tussen de primaire plasmaconcentraties van PEA en OEA en de spermakwaliteit en het effect van deze verbindingen op de beweeglijkheid, levensvatbaarheid en mitochondria-activiteit van sperma in vitro.

Resultaat (en): Palmitoylethanolamide en OEA-concentraties in het seminale plasma waren lager bij mannen met asthenozoospermie en oligoas-thenoteratozospermie in vergelijking met mannen met normale spermaparameters. Palmitoylethanolamide en OEA snel en aanzienlijk verbeterd spermamotiliteit en onderhouden levensvatbaarheid zonder de mitochondria activiteit in vitro.

Conclusie (s): Het behoud van normale PEA- en OEA-tonus in menselijk zaadplasma kan noodzakelijk zijn voor het behoud van de normale spermafunctie en mannelijke vruchtbaarheid. Exocannabinoïden gevonden in cannabis, zoals delta-9-tetrahydrocannabinol en

cannabidiol, zou kunnen concurreren met deze endocannabinoïden die hun fijn gebalanceerde, normale werking verstoren en resulteren in mannelijke reproductieve mislukkingen. (Fertil Steril 2014; 102: 1260-7. 2014 door American Society voor

Reproductieve geneeskunde.)

Sleutelwoorden: Palmitoylethanolamide, oleoylethanolamide, anandamide, endocannabinoïde systeem, seminale plasma

Bespreek: u kunt dit artikel bespreken met de auteurs en met andere ASRM-leden op http: // fertstertforum.com/amoakoa-anandamide-congeners-palmitoylethanolamide-oleoylethan olamide /

Gebruik je smartphone om deze QR-code te scannen en maak nu verbinding met het discussieforum voor dit artikel. *

Download een gratis QR-codescanner door te zoeken naar "QR-scanner" in de app store of app-marktplaats van uw smartphone.

Verkregen 20 januari 2014; herzien en geaccepteerd op 9 juli 2014; online gepubliceerd op 8 september 2014.

AAA heeft niets te onthullen. THM heeft niets te onthullen. JE heeft niets te onthullen. AHT heeft niets te onthullen. JMW heeft niets te onthullen. JCK heeft niets te onthullen.

Huidig adres voor AAA: Leeds Centre for Reproductive Medicine, Leeds Teaching Hospitals NHS Trust, Seacroft Hospital, Leeds LS14 6UH, Verenigd Koninkrijk.

Gedeeltelijk ondersteund door diverse educatieve fondsen van de universitaire ziekenhuizen van Leicester National Health Services Trust ter ondersteuning van het Endocannabinoid Research Laboratory van de universiteit van Leicester.

Herdrukverzoeken: Akwasi Atakora Amoako, B.Sc., MB, Ch.B., MRCOG, Ph.D., en Justin Chi Konje, MD, FRCOG, Endocannabinoid Research Group, Reproductive Science Section, Department of Cancer Studies and Molecular Medicine , University of Leicester, Leicester, Verenigd Koninkrijk (E-mail: akwasi.amoako@leedsth.nhs.uk).

Fertility and Sterility® Vol. 102, nr. 5, november 2014 0015-0282 / $ 36,00

Copyright © 2014 American Society for Reproductive Medicine, gepubliceerd door Elsevier Inc. http://dx.doi.org/10.1016/j.fertnstert.2014.07.767

I onvruchtbaarheid treft een op de zes (15% -20%) paren die proberen een zwangerschap te bereiken (1-4). Vrouwelijke factoren zijn verantwoordelijk voor de helft van de gevallen van onvruchtbaarheid, terwijl mannelijke factoren zuiver of in combinatie met vrouwelijke factoren verantwoordelijk zijn voor de resterende 50% (3, 5). Mannelijke factor onvruchtbaarheid is een complex en groeiend probleem (6) met multifactoriële oorzaken en meestal aanwezig als kwalitatief of kwantitatief

1260

VOL. 102 NO. 5 / NOVEMBER 2014

spermadefecten in de vorm van een tekort aan spermaproductie, transport en / of morfologie (7). Sperma-analyse blijft de standaardmethode voor de evaluatie van onvruchtbaarheid bij mannelijke factoren, maar kan de oorzaken van spermadisfunctie niet verklaren. Recente studies hebben zich gericht op een aantal moleculen met voorspellende waarde van het mannelijke reproductievermogen. Hiertoe behoren een groep lipidenbemiddelaars, de endocannabinoïden die opkomen als potentiële biomarkers voor de reproductieve gezondheid van mannen (8).

Endocannabinoïde zijn endogene bioactieve lipide media-

die binden aan cannabinoïde-receptoren en de nadelige voortplantingseffecten van cannabis nabootsen. De endocannabinoïden, hun

moleculaire doelwitten, synthetische en afbraak-enzymen en eiwittransporteurs vormen het endocannabinoïdesysteem. De cannabinoïde receptoren werden voor het eerst geïdentificeerd als moleculaire doelwitten voor D 9 -tetrahydrocannabinol, het actieve bestanddeel van marihuana en later werden twee goed gekarakteriseerde G-eiwit-gekoppelde cannabinoïde receptoren, CB1 en CB2 (9, 10), die ook endocannabinoïden binden .

N-arachidonoylethanolamide (Anandamide, AEA) is het meest uitgebreid bestudeerde lid van deze groep liganden en is wijd verspreid in de meeste centrale en perifere weefsels, inclusief het voortplantingssysteem (11-13). De AEA en zijn congeneren oleoylethanolamide (OEA) en palmitoylethanolamide (PEA), gewoonlijk aangeduid als N-acylethanolamiden, zijn hydrofobe moleculen die aanwezig zijn in het lage nanomolaire bereik in veel zoogdierweefsels en cellen en geproduceerd uit celmembraam fosfolipide voorlopers in reactie op depolariserende middelen neurotr-ansmitters en hormonen (14, 15). Ze lijken altijd samen voor te komen in weefsels en biovloeistoffen, wat een gemeenschappelijk productiepad suggereert.

Oleoylethanolamide en PEA activeren de klassieke cannabinoïde-receptoren CB1 en CB2 niet en hun exacte biologische eigenschappen blijven ongrijpbaar. Ze worden verondersteld te fungeren als '' entourage-verbindingen '', waardoor ze de biologische activiteit van AEA versterken door de afbraak ervan te remmen door het enzym vetzuuramide-hydrolase, dat als alternatieve substraten fungeert. Concentraties van AEA, PEA en OEA zijn gedetecteerd op nanomolaire niveaus in menselijke voortplantingsvloeistoffen en -weefsels, zoals ovaalvloeistof in de midcycle, folliculair vocht (FF) en zaadplasma (16-18), en er is aangetoond dat spermatozoa opeenvolgend blootgesteld aan afnemende niveaus van AEA terwijl ze zwemmen van het ejaculaat dat in de vagina is afgezet naar de bevruchtingsplaats in de oviductale ampulla (18).

Verschillende in vitro studies hebben een dosisafhankelijke remming van zoogdierlijke spermafuncties aangetoond door AEA gemedieerd door CB1-receptoractivering (19-21). In rijpe humane spermatozoa vermindert AEA de motiliteit van het sperma, de capacitatie en acrosomale exocytose (21). Evenzo oefent AEA een remmende rol uit op de spermafuncties in verschillende soorten (18, 19, 21, 22) door remming van de mitochondriale activiteit die energie spaart en zorgt voor een geleidelijke verwerving van de vruchtbaarheid van het sperma tijdens de opstijging door het vrouwelijke voortplantingsstelsel (23). Evenzo interfereert D9-tetrahydrocannabinol met stroomafwaartse endogene signaalroutes, modulerende spermafuncties en mannelijke reproductie in ongewervelde dieren en zoogdieren (18, 19, 21, 24).

Vruchtbaarheid en Steriliteit®

Er wordt gedacht dat een kritische '' endocannabinoïde toon '' vereist is voor het handhaven van zoogdierlijke spermatozoa in de normale toestand en verlies van deze endocannabinoïde beschermende functies resulteert in spermadisfunctie en verlies van bemestingspotentieel. Ondersteuning hiervoor komt uit de waarnemingen dat neerwaartse regulatie van AEA-tonus en CB1-expressie in respectievelijk zaadplasma en spermatozoïden voorkomt bij mannen met abnormale semenparameters, wat aangeeft dat afwijkende endocannabinoïdesignalering bij humane sperma-tozoa een rol speelt die relevant is in de etiopathogenese van menselijke spermadisfunctie (25, 26).

Palmitoylethanolamide en OEA-concentraties in de meeste menselijke voortplantingsorganen en -vloeistoffen zijn hoger dan die van AEA, met opkomend bewijs dat suggereert dat PEA en OEA antioxiderende, ontstekingsremmende en antimicro-biële activiteiten hebben die spermacellen zouden kunnen beschermen tegen oxidatieve schade, ontsteking en microbiële activiteit. PEA- en OEA-suppletie verbetert bijvoorbeeld de anti-spijsverteringsactiviteit van het sperma, verbetert kinematische spiegels van het sperma en hyperac tivering en beschermt cellen tegen oxidatieve schade in sommige gevallen van idiopathische onvruchtbaarheid (27-29).

We stelden voor dat de spiegelkwaliteit van spermakwaliteit kan worden weerspiegeld in de spiegels van PEA en OEA. De doelstellingen van deze studie waren daarom het verkennen van mogelijke relaties tussen PEA en OEA seminale plasmaconcentraties en spermakwaliteit en om de effecten van deze verbindingen op menselijke sperma-tozoa in vitro te bepalen.

MATERIALEN EN METHODES

Chemicaliën

Dimethylsulfoxide (DMSO) en mierenzuur waren van Sigma Aldrich. Palmitoylethanolamide, OEA en hun gedeutereerde equivalenten (PEA-d4 en OEA-d2), elk> 98% zuiver (en> 99% gedeutereerd gehalte), en 5,5 0,6,6 0 -tetrachloor-1,1 0 3,30-tetraethylbenzimidazolylcarbocyaninejodide (JC-1) werd gekocht van Cayman Chemicals. De hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC) kwaliteit acetonitril, chloroform, methanol en ammoniumacetaat werden gekocht bij Fisher Scientific en water van HPLC kwaliteit werd verkregen met behulp van een waterzuiveringssysteem (Maxima ELGA, ELGA). Mobiele fasen werden vóór gebruik gefiltreerd door 0,2-mm, 47-mm diameter polyte-trafluorethyleenfilters (Waters UK Ltd.). Oasis hydrofiele-Lipophilic-Balanced (HLB) vaste fase extractiecartridges (1 ml, 30 mg) werden gekocht bij Waters. Live / dode spiilevensvatbaarheidskit werd verkregen van Invitrogen.

Studie ontwerp

Deze prospectieve studie werd goedgekeurd en uitgevoerd volgens de richtlijnen van de plaatselijke commissie voor ethiek van Leicestershire en Rutland en alle deelnemers ondertekenden toestemming om deel te nemen. Sperma werd verkregen van mannen die deelnamen aan de Andrology Unit van de Leicester Royal Infirmary, een gelieerd ziekenhuis van de University of Leicester School of Medicine voor routinematige sperma-analyse. Sperma werd verzameld van 90 opeenvolgende patiënten door masturbatie in een steriele plastic container na 2-5 dagen van seksuele onthouding. Monsters mochten vloeibaar worden bij kamertemperatuur voor

VOL. 102 NO. 5 / NOVEMBER 2014 1261

OORSPRONKELIJK ARTIKEL: ANDROLOGIE

1 uur. Uit een deel van het sperma werden standaard zaadparameters onderzocht door een getrainde laboratoriumtechnicus met inachtneming van de interne kwaliteitscontrolemaatregel van de afdeling en in overeenstemming met de criteria van de Wereldgezondheidsorganisatie (30). Wereldgezondheidsorganisatie refererende normale waarden waren spermavolume> 2 ml; spermaconcentratie> 20 10 6 / ml; aantal zaadcellen per ejaculum van> 40 10 6 ; en spermamotiliteit van R50% met voorwaartse progressie (graad a en b) of R25% met progressieve beweeglijkheid (graad a). Patiënten met vroeger of actueel gebruik van recreatieve drugs, het huidige gebruik van medicatie (behalve overcounter medicatie), de aanwezigheid van een systemische ziekte of een voorgeschiedenis van vasectomie waren uitgesloten. De 90 deelnemers werden vervolgens gekarakteriseerd en in een van de vijf groepen ingedeeld als normo-zoöspermie (n ¼ 45), asthenozoöspermie (n ¼ 11), oligoasthe-noteratozoospermia (n ¼ 22), teratozoöspermie (n ¼ 8) of azoöspermie (n ¼ 4).

Meting van PEA en OEA in menselijk zaadplasma

Sperma werd op ijs naar het analytisch laboratorium getransporteerd en binnen 2 uur na productie verwerkt. Het fluïdum werd overgebracht in een schoon Kimble-scintillatieflesje van 7 ml (Kinesis) en 30 minuten bij 4 ° C bij 1200 g gecentrifugeerd om zaadcelmengsel te scheiden van spermatozoa en andere verontreinigende cellen. Het supernatant werd vervolgens overgebracht in een schoon 7 ml Kimble-scintillatieflesje en lipide-extractie onmiddellijk uitgevoerd, zoals eerder beschreven (31, 32). Een eerder gevalideerde ultra HPLC-tandem elektrospray ionisatie-massaspectrometrische methode (31, 32) werd gebruikt voor de analyse en kwantificering van PEA en OEA in de 90 spermamonsters.

Voorbereiding op sperma voor in vitro experimenten

In vitro experimenten werden uitgevoerd in gemodificeerd Biggers, Whitten Whittingham (BWW) medium (5,6 mM D-glucose, 44 mM natriumlactaat, 0,27 mM natriumpyruvaat, 95 mM NaCl, 4,6 mM KCI, 1,7 mM CaCl2, 1,2 mM KH 2 PO 4 , 1,2 mM MgS04, 5 U / ml penicilline, 5 mg / ml streptomycine, gebufferd met 20 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N 0 -2-ethaansulfonzuur [HEPES] en aangevuld met 0,3% runderserumalbumine [BSA ], pH aangepast tot 7,4). Voor deze experimenten werden alleen spermamonsters gebruikt die waren gedoneerd door gezonde vrijwilligers met normale parameters van de Wereldgezondheidsorganisatie. Na sperma-liquefactie gedurende ongeveer 30 mi-nutes, werden beweeglijke spermatozoa geselecteerd door middel van de directe swim-up-techniek in BWW-medium. In het kort werd 1 ml BWW gebufferd met HEPES (20 mM) en pH ingesteld op 7,4 onderlaag met 0,3 ml van het vloeibaar gemaakte monster in een polystyreen Falcon buis met ronde bodem (Becton Dickinson) en gedurende 1 uur bij 37 ° C geïncubeerd, 5% CO 2 , en in een hoek van 45. Na incubatie werd 700 ml voorzichtig afgezogen van de bovenste laag van elke buis, die de beweegbare cellen bevatte, samengevoegd in een 15-mL polystyreen Falcon buisje, twee keer gewassen (700 g gedurende 7 minuten), en geresuspendeerd in BWW-medium (33). De spermaconcentratie werd bepaald met behulp van een Neubauer-telkamer, in overeenstemming met de World Health Or-

analysemethoden (30) en aangepast tot 10 miljoen cellen / ml met BWW-medium. Voorraadoplossingen van PEA en OEA (1 mM in DMSO) opgeslagen bij 20 ° C werden onmiddellijk voor elk experiment verdund tot de vereiste concentratie in 1 ml BWW-kweekmedium, zodanig dat de uiteindelijke DMSO-concentratie 0,2% (vol / vol) was , met hetzelfde volume DMSO in BWW-medium dat werd gebruikt in alle controle-experimenten (voorlopige experimenten toonden aan dat 0,2% DMSO geen significante effecten had op de motiliteit van sperma).

Effect van PEA en OEA op de beweeglijkheid en levensvatbaarheid van sperma

Porties van gesuspendeerd sperma (10 ml) werden 15, 30, 45, 60 en 90 minuten na de toevoeging van PEA of OEA genomen om het tijdsafhankelijke effect hiervan op de motiliteit van het sperma te onderzoeken. Dosis-responscurves werden geconstrueerd door porties van spermasuspensie (10 106 / ml) zonder (controle) of met toenemende concentraties van PEA of OEA (1 nM-10 mM) gedurende 30 minuten op te nemen. De beweeglijkheid van het sperma werd beoordeeld door 10 ml spermasuspensie te plaatsen op een schone glasplaat bedekt met een 22 mm 22 mm dekglaasje en gemonteerd op een fasecontrastmicroscoop met een verwarmd stadium om de glastemperatuur op 37 ° C te houden. In totaal waren 200 cellen scoorde uit verschillende velden en het aandeel van beweeglijke spermatozoa werd uitgedrukt als een percentage van het totale motiele sperma. Elk monster werd geanalyseerd in triplicaten en de gemiddelde waarde werd genomen als het percentage beweeglijkheid. Een vierde monster werd geanalyseerd waarbij er> 10% variatie tussen de drie monsters was. Alle analyses werden uitgevoerd door het onderzoeksteam onder supervisie van een opgeleide laboratoriumtechnicus. Het effect van PEA of OEA op de levensvatbaarheid van het sperma werd beoordeeld na 6 uur incubatie met behulp van de LIVE / DEAD-sperma-leefbaarheidskit (Invitrogen), volgens de instructies van de fabrikant door het bekijken van SYBR-14 (groen) en PI (rood) cellulaire fluorescentie labelingpatronen met een vergroting van 400 op een Nikon Eclipse 300 mi-croscope. Een totaal van 200 cellen uit acht willekeurig geselecteerde velden werd onderzocht op groene en rode fluorescentie en de levensvatbaarheid van het sperma werd uitgedrukt als een percentage van cellen die groene fluorescentie uitsluiten.

Flowcytometrische evaluatie van mitochondriaal membraanpotentieel

De lipofiele kationische kleurstof JC-1 werd gebruikt om de toestand van de mitochon-droogte te bepalen door het mitochondriale membraanpotentiaal (Djm) van spermatozoa te karakteriseren, zoals eerder beschreven (26). In het kort werden hoeveelheden van 1 ml spermatozoa (5 10 6 / ml) geïncubeerd met toenemende concentraties van PEA of OEA (1 nM-1 mM) bij 37 ° C onder een atmosfeer van 5% CO2 in lucht gedurende 15 minuten, waarna 0,15 mmol / L JC-1 werd toegevoegd en de cellen werden verder gedurende 30 minuten geïncubeerd. De groene (monomeer lage) en oranje (multimere hoogte) JC-1 mito-chondriale membraanpotentialen werden gevolgd door stroomcytometrie met behulp van een BD FACSAria II celsorteerder (BD Biosciences) uitgerust met een 488-nm argonlaser als excitatielichtbron . Een totaal van 10.000 gated events werden verzameld per sample met een snelheid van 500 events / s. Niet-spermageactiviteiten werden afgesloten met 1262 VOL. 102 NO. 5 / NOVEMBER 2014

Vruchtbaarheid en Steriliteit®

TAFEL 1

Spezeleigenschappen en gemiddelde concentraties van NAE's in de onderzoeksgroepen (uitgedrukt als mediaan en 95% betrouwbaarheidsinterval).

veranderlijk

Volume (ml)

Aantal sperma (310 6 / ml)

Motiliteit (%)

Normale vormen (%)

Normozoöspermie (n ¼ 45)

3.0

(2,9-3,9)

156

(129-187)

72 (67-73)

50

(44-51)

Asthenozoospermie (n ¼ 11)

2.0

(1,7-3,7)

80

(42-158)

32 (22-40)

24

(12-36)

Teratozoospermie (n ¼ 8)

3.3

(2,2-4,7)

49

(32-82)

54 (31-69)

5

(2-16)

Oligoasthenoteratozoospermia (n ¼ 22)

3.2

(1-5,9)

4

(3-10)

31 (22-40)

12

(8-18)

Azoospermia (n ¼ 4)

3.8

(3,2-4,7)


NA

NA


NA

Opmerking: NA ¼ niet beschikbaar; NAE ¼ N-acylethanolamide.

Amoako. Endocannabinoïden bij mannelijke reproductie. Fertil Steril 2014.

uit de cellen van interesse op basis van de voorwaartse verstrooiing en zijwaartse verspreiding van de spermapopulatie vastgelegd in de lineaire modus. De JC-1 groene en oranje fluorescentie werden gedetecteerd bij respectievelijk 530 nm en 610 nm. Flowcytometrische gegevens werden geanalyseerd met BD FACSDiVa Software (BD Biosciences) in de logaritmische modus. De populatie van oranje gekleurde cellen werd geregistreerd als het percentage cellen met een hoog mito-chondriaal membraanpotentiaal.

Statistische analyse

Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van Graphpad (Instat versie 3, Graphpad Software). Statistische vergelijking van endocannabinoïde concentraties bij mannen met normale en pathologische zaadparameters werd bereikt met behulp van een Kruskal-Wallis one-way analyse van variantie (ANOVA) met Dunn's ad-hoc post-test. Voor de in vitro experimenten werden vergelijkingen tussen behandelde en controlemonsters bereikt door gebruik te maken van eenwegs ANOVA met de posttest van Dunnett. In alle gevallen werd P <0,05 als="" statistisch="" significant="">

RESULTATEN

Verband tussen spiegels van seminal plasma van PEA en OEA en spermakwaliteit

Wereldgezondheidsorganisatie criteria voor spermaconcentratie, motiliteit en morfologie werden gebruikt om de 90 mannen te groeperen in 5 pathologische en normale groepen: asthenozoospermia, oligoasthenoteratozoospermia, teratozoospermia, azoo-spermia of normozoöspermie. De vijf groepen hadden een vergelijkbare gemiddelde leeftijd en hun basissperma-parameters zijn weergegeven in Tabel 1.

De seminale plasmaconcentraties van PEA waren significant lager bij mannen met asthenozoöspermie (mediaan, 6,23 nM, interkwartielbereik [IQR], 2,88-7,58, 95% betrouwbaarheidsinterval [BI] 3,51-7,38) en oligoasthenoteratozoospermie (mediaan, 3,02 nM; IQR, 2.17-8.44; 95% CI 3.29-7.25) vergeleken met de normozoöspermische controles (mediaan, 11.94 nM; IQR, 7.81-15.17; 95% CI 10.44-16.08). Er werd geen significant verschil gezien tussen mannen met teratozoospermie (mediaan, 10,62 nM; IQR, 5,64-21,39; 95% CI 3,51-7,38) of

FIGUUR 1

image017.jpg

Verband tussen seminale plasmaspiegels van palmitoylethanolamide (PEA) en oleoylethanolamide (OEA) en spermakwaliteit. De abdominale plasmaspiegels van (A) PEA en (B) OEA werden gekwantificeerd met behulp van ultra-performance-vloeistofchromatografie-tandem electrospray-ionisatie-massaspectrometrie bij mannen met normozoöspermie, asthenozoöspermie, teratozoöspermie, azoöspermie en oligoasthenoteratozoospermie. Gegevens worden gerapporteerd als mediaan en interkwartielbereik en alle monsters werden als duplicaten verwerkt. De vergelijking tussen groepen werd gemaakt met behulp van Kruskal-Wallis one-way-analyse van de variantie (ANOVA) gevolgd door de ad hoc-test van Dunn. * P, ** P, *** P geeft gegevens significant weer (P <.05, p=""><.01, en="" p=""><.001 respectievelijk)="" en="" ns="" staat="" voor="" gegevens="" die="" niet="" significant="" lager="" zijn="" dan=""> NOR ¼ normozoöspermie (n ¼ 45); AST ¼ asthenozoospermia (n ¼ 11); TER ¼ teratozoospermia (n ¼ 8); AZO ¼ azoöspermie (n ¼ 4); OAT ¼ oligoasthenoteratozoospermia (n ¼ 22).

Amoako. Endocannabinoïden bij mannelijke reproductie. Fertil Steril 2014.

VOL. 102 NO. 5 november NOVEMBER 2014 1263

OORSPRONKELIJK ARTIKEL: ANDROLOGIE

azoöspermie (mediaan, 5,77 nM, IQR, 3,55-16,49; 95% CI -3,55-20.76) vergeleken met de normozoöspermische controles (figuur 1A). De sptere plasmaconcentraties in de OEA waren significant lager bij mannen met asthenozoospermie (mediaan, 0,86 nM, IQR, 0,35-0,95, 95% BI 0,50-0,89), oligoasthenoter-atozoöspermie (mediaan, 0,52 nM, IQR, 0,29-0,87; 95 % CI 0,47-0,74) en azoöspermie (mediaan, 0,29 nM; IQR, 0,24-

0,39; 95% betrouwbaarheidsinterval 0,19-0,41) vergeleken met de normozoo-spermische controles (mediaan, 1,52 nM; IQR, 0,57-2,30; 95% CI 1,24-2,26), hoewel er geen significant verschil werd gezien bij mannen met teratozoospermie (mediaan, 1,02 nM ; IQR, 0,46 - 1,74; 95% CI 0,06-2,93) (Fig. 1B).

Tijd- en dosisafhankelijke effecten van PEA en OEA op de beweeglijkheid van sperma

Na 15-90 minuten incuberen, oefende PEA een significante (P <.001) tijdsafhankelijke="" toename="" in="" progressieve="" beweeglijkheid="" van="" het="" sperma="" uit="" (77%,="" 81%,="" 81%,="" 80%="" en="" 80%="" op="" 15,="" 30,="" 45="" respectievelijk="" 60="" en="" 90="" minuten),="" terwijl="" controlesperma="" op="" de="" overeenkomstige="" tijden="" een="" significante="" afname="" vertoonde="" (70%,="" 70%,="" 69%,="" 69%="" en="" 67%)="" (figuur=""> Oleoylethanola-mide induceerde ook een significante (P <.001) tijdsafhankelijke="" toename="" in="" de="" progressieve="" beweeglijkheid="" van="" het="" sperma="" (respectievelijk="" 74%,="" 77%,="" 79%,="" 79%="" en="" 76%)="" vergeleken="" met="" de="" controles="" bij="">

FIGUUR 2

image022.jpg

overeenkomstige tijd (69%, 69%, 69%, 67% en 67%) (Fig. 2B). Blootstelling van sperma aan toenemende doses van PEA of OEA (10 nM-10 mM) gedurende 30 minuten resulteerde in een significante dosis-afhankelijke toename in het percentage van progressieve beweeglijkheid van het sperma voor zowel PEA als OEA (one-way ANOVA, P> .05; n ¼ 6) (Fig. 2C en D).

Effect van PEA en OEA op de levensvatbaarheid en mitochondria-activiteit van het sperma

Behandeling van spermatozoa met toenemende doses PEA (10 nM - 10 mM) gedurende 6 uur resulteerde in een significant dosisafhankelijk onderhoud van de levensvatbaarheid van het sperma vergeleken met het controlesperma (P <.001, one-way="" anova;="" n="" ¼="" 6)="" (fig.=""> Het effect van OEA (10 nM-10 mM, 6 uur) op de levensvatbaarheid van het sperma resulteerde ook in een significant dosisafhankelijk, onderhoud van de levensvatbaarheid van het sperma in vergelijking met de voertuigcontrole (P <.001, one-way="" anova;="" n="" ¼="" 6)="" (fig.=""> Incubatie met tot een concentratie van 10 mM, PEA of OEA induceerde geen significante veranderingen in de mitochondriale activiteit van het sperma zoals gemeten door mitochondriamembraanpotentiaal (Fig. 3C en D).

DISCUSSIE

Mannelijke factor onvruchtbaarheid is een wereldwijd probleem dat zich in de groei bevindt en hoewel de precieze etiopathologie onbekend is

Effect van palmitoylethanolamide (PEA) en oleoylethanolamide (OEA) op de beweeglijkheid van het sperma. Humane spermatozoa werden geïncubeerd in Biggers, Whitten Whittingham (BWW) medium bij 37 ° C in een 5% CO2-incubator en gestimuleerd met (blauw) of zonder (rood) (A) PEA of (B) OEA (1 mM) voor maximaal 90 minuten. Hoeveelheden van 10 ml werden genomen bij 15, 30, 45, 60 en 90 minuten en de motiliteit van het sperma werd geëvalueerd met behulp van fasecontrastmicroscopie. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde SEM (n ¼ 4 afzonderlijke experimenten). Aanzienlijke verschillen werden bepaald door tweeweg variantieanalyse (ANOVA). Paarsgewijze vergelijking tussen de behandelde en tijdgestuurde controles werd bepaald door de gepaarde Student's t-test; * P <.05, **="" p=""><.01, ***="" p=""><> Menselijke spermatozoa werden geïncubeerd in BWW-medium bij 37 ° C en gestimuleerd met of zonder toenemende concentraties van PEA (C) of OEA (D) gedurende maximaal 30 minuten. Porties van 10 ml werden genomen en de beweeglijkheid van het sperma werd geëvalueerd door middel van fasecontrastmicroscopie en uitgedrukt als een percentage beweeglijk sperma. Kolommen zijn gemiddelde SEM van zes onafhankelijke experimenten die in duplo zijn uitgevoerd. Aanzienlijke verschillen werden bepaald door een post-hoc test in één richting ANOVA en Dunnett; ** P <.01, ***="" p=""><.001 versus="">

Amoako. Endocannabinoïden bij mannelijke reproductie. Fertil Steril 2014.

1264 VOL. 102 NO. 5 / NOVEMBER 2014

Vruchtbaarheid en Steriliteit®

FIGUUR 3

image025.jpg

Effect van palmitoylethanolamide (PEA) en oleoylethanolamide (OEA) op de levensvatbaarheid en mitochondria-activiteit van het sperma. Humane spermatozoa werden geïncubeerd in Biggers, Whitten Whittingham (BWW) medium bij 37 ° C in een 5% CO2-incubator en gestimuleerd met of zonder toenemende concentraties van (A) PEA of (B) OEA (10 nM-10 mM) voor maximaal 6 uur. De levensvatbaarheid van het sperma werd gemeten met behulp van de Live / Dead-bepaling van de levensvatbaarheid van spermacellen en fluorescentiemicroscopie en uitgedrukt als percentage van levensvatbaar sperma. Kolommen zijn gemiddelde SEM van zes onafhankelijke experimenten die in duplo zijn uitgevoerd. Aanzienlijke verschillen werden bepaald door de one-way variantieanalyse (ANOVA) en de post hoc-test van Dunnett. ** P <.01, ***="" p=""><.001 versus="" 0="" nm="" pea="" of=""> Humane spermatozoa werden geïncubeerd in BWW-medium bij 37 ° C in een 5% CO2-incubator en gestimuleerd met of zonder toenemende concentraties van (C) PEA of (D) OEA (10 nM-1 mM) gedurende maximaal 30 minuten. Aliquots van spermasuspensie werden gekleurd met fluorescentiekleurstof JC-1 en mitochondria-activiteit gevolgd door flowcytometrie. De grafieken geven het percentage aan van spermacellen die oranje fluorescentie vertonen, wat de hogere mitochondriale activiteit aangeeft, in de aanwezigheid van de aangegeven doses van PEA of OEA. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde SEM van vier afzonderlijke experimenten, elk uitgevoerd in duplo's.

Amoako. Endocannabinoïden bij mannelijke reproductie. Fertil Steril 2014.

in de meeste gevallen is een defecte spermafunctie van oxidatieve stress geïmpliceerd (34). Dit is het gevolg van ofwel een toename in reactieve zuurstofspecies (ROS) of een afname van de antioxidantcapaciteit van het lichaam die resulteert in peroxidatieve schade aan het plasmamembraan van het sperma. De ROS speelt een belangrijke rol bij postejaculatoire rijpingsverschijnselen van zaadcellen, zoals capacitatie en de acrosoomreactie, maar kan bij hoge concentraties onherstelbare schade aan het plasmamembraan van het sperma veroorzaken. Dit kan resulteren in verlies van beweeglijkheid van het sperma en sperma-DNA-fragmentatie die spermadisfunctie veroorzaakt en verlies van bemestingspotentieel. Zo werd gesuggereerd dat een evenwicht tussen de ROS-generatie en de totale antioxidantcapaciteit een cruciale rol speelt in de pathofysiologie van de ziektetoestand (35). Verschillende antioxidantia, enzymatische (superoxide dis-mutase, catalase en glutathione peroxidase) en nonenzy-matic (bijvoorbeeld a-tocoferol, b-caroteen, ascorbaat, uraat), zijn gebruikt als antioxidant-suppletie om spermacellen te beschermen (36) . Deze middelen zijn aanwezig in seminaal plasma en hun gebruik om de zaadparameters te verbeteren blijft controversieel. Hoewel eerdere onderzoeken geen verbetering in de spermaparameters na antioxidantensuppletie aan het licht brachten (37), hebben recentere studies bewijs van voordeel aangetoond (38-40). Opduikend bewijs suggereert dat N-acylethanolamiden, vooral PEA en OEA, antioxiderende, antimicrobiële en anti-inflammatoire eigenschappen hebben en de radicalen kunnen remmen die worden geïnduceerd door in vitro oxidatie van lipiden (41, 42). Deze verbindingen zijn in eerdere studies getoond om de productie van stikstofoxide in macrofagen te remmen (43) en om geïsoleerd rattenhart te beschermen tegen ischemie (44) door hun antioxiderende effecten. De aanwezigheid van hogere concentraties van deze verbindingen in seminair plasma suggereert dat ze kunnen bijdragen aan het antioxidantvermogen van menselijke voortplantingsvloeistoffen, wat hun gunstige effecten op de capaciteiten, beweeglijkheid en levensvatbaarheid van het sperma zou kunnen verklaren (27-29). De bron van PEA en OEA in het seminale plasma blijft onbekend en is in dit onderzoek niet onderzocht. De spermatozoa zelf kunnen echter de bron zijn, omdat ze de biochemische apparatuur bezitten voor de synthese en degradatie van PEA en OEA (26). Bijdrage van de epidydimis, prostaat en zaadblaasjes is mogelijk. Daarnaast zijn cannabinoïde-receptoren en endocannabinoïde synthetische en afbraak-enzymen gelokaliseerd

VOL. 102 NO. 5 / NOVEMBER 2014 1265

OORSPRONKELIJK ARTIKEL: ANDROLOGIE

fallopisch eileinepitheel, wat duidt op blootstelling van spermatozoa aan de endocannabinoïden in het vrouwelijke geslachtsorgaan (45-48).

In de huidige studie toonde de relatie tussen PEA en OEA seminale plasmaconcentraties en humane spermeabradicaliteiten en -functies opmerkelijke verschillen in OEA- en PEA-concentraties bij mannen met verschillende pathologische sperma-subtypes, met lagere niveaus geassocieerd met een verminderd aantal spermacellen en abnormale spermamotiliteit . Deze waarneming geeft aan dat om het normale aantal en de beweeglijkheid van het sperma te behouden, hogere niveaus van PEA en OEA nodig zijn in het mannelijke geslachtsorgaan. Dit suggereert dat PEA en OEA belangrijke fysiologische rollen in het mannelijke geslachtsorgaan kunnen spelen en daarom kan verlies van '' PEA- en / of OEA-toon '' bij mannen met abnormale spermaparameters wijzen op afwijkende endocannabinoïdesignalering bij menselijke spermatozoa. Dit kan relevant zijn in de etiopatho-genese van menselijke spermadisfunctie en verminderde mannelijke vruchtbaarheid. Zodoende resulteert deregulering van het endogene endocannabi- noid-systeem tijdens spermadifferentiatie en / of rijping waarschijnlijk in de productie van spermatozoa met abnormale morfologie en hogere niveaus van DNA-fragmentatie. Dit is een gemeenschappelijk kenmerk dat wordt geassocieerd met spermatozoa van mannen met asthenozoospermie en oligoasthenoteratozo-spermia. De effecten van PEA en OEA op de motiliteit, levensvatbaarheid en mitochondriale activiteit van menselijke sperma werden onderzocht om de mogelijke rol van deze verbindingen in de spermafunctie van de mens te begrijpen. Zowel PEA als OEA verhoogden de spermamotiliteit op een tijd- en concentratieafhankelijke manier aanzienlijk en hielden de vitaliteit van het sperma in vitro gedurende een periode van 6 uur op een concentratieafhankelijke manier aanzienlijk in stand. Het snelle effect van PEA en OEA op de motiliteit van sperma ondersteunt de hypothese van een beschermende werking van PEA en OEA tegen ROS, wat de gunstige effecten op in vitro ca-pacitated spermatozoa (27-29) zou kunnen verklaren. Palmitoylethanolamide en OEA zijn aangetoond bij fysiologische concentraties, zoals gedetecteerd bij deze mannen, om kinematische parameters te verhogen, zoals kromlijnige snelheid en amplitude van zijwaartse kopverplaatsing en hyperactivering, in de aanwezigheid en afwezigheid van oxidatieve stress (27-29). In vitro blootstelling van menselijke spermatozoa aan PEA en OEA verleende enige bescherming tegen oxidatieve schade en beschermde deze cellen tegen oxidatieve schade in sommige gevallen van idiopathische onvruchtbaarheid (27-29). Bovendien suggereren de snelle effecten van PEA en OEA op sperma dat deze middelen hun fysiologische rol kunnen uitoefenen op humane spermatozoa door andere mogelijke mechanismen die geen ROS omvatten, zoals die waarvoor geen CB-receptoren nodig zijn, die in menselijk sperma kunnen worden opgenomen, zoals als de GPR55, GPR119 en de peroxisoom proliferator-geactiveerde receptoren (18).

De lipofiele aard van PEA en OEA suggereert dat deze verbindingen een interactie kunnen aangaan met lipide dubbellagen van spermaplasmamembraan en de membraanpolariteit (49-51) kunnen veranderen om veranderingen in plasmamembraamsamenstelling en vloeibaarheid te induceren. Dit zou de membraanpermeabiliteit voor sommige moleculen verhogen, zoals calcium en bicarbonaat, die essentieel zijn voor de inductie van beweeglijkheid en capacitatie van het sperma (29). Verminderde plasmamembraanvloeibaarheid en polariteit van het sperma zijn algemene kenmerken geassocieerd met spermatozoën van mannen met oligozoöspermie en sommige idiopathische normozoöspermische mannen

(52) en van PEA en OEA is bekend dat ze de snelheid van capacitatie in sperma van mannen met oligozoöspermie en idiopathische normozoöspermische mannen die een verminderde membraanpolariteit vertonen, verhogen (29).

Concluderend kunnen de PEA- en OEA-spiegels in menselijk zaadplasma de algehele reproductieve gezondheid van de man weerspiegelen, inclusief de teelballen, epididymides en bijkomende reproductieve klieren, en zouden ze kunnen worden uitgebuit als biomarkers voor onvruchtbaarheid bij mannelijke factoren. Palmitoylethanolamide en OEA kunnen daarom een cruciale rol spelen bij het behoud van de normale spermafunctie en mannelijke vruchtbaarheid. Exocannabinoïden, zoals D 9 -tetrahydrocannabinol en cannabidiol, concurreren met deze lipidemediatoren en kunnen hun fijn gebalanceerde, normale werking verstoren en dus resulteren in mannelijke reproductieve insufficiëntie. Verdere onderzoeken naar de rol van endocannabioïden en exocannabioïden in de mannelijke vruchtbaarheid zijn dus vereist.

Referenties

1. Bhattacharya S, Porter M, Amalraj E, Templeton A, Hamilton M, Lee AJ, et al. The epidemiology of infertility in the North East of Scotland. Hum Reprod 2009;24:3096–107.

2. Templeton A, Fraser C, Thompson B. The epidemiology of infertility in Aber-deen. BMJ 1990;301:148–52.

3. Hull MG, Glazener CM, Kelly NJ, Conway DI, Foster PA, Hinton RA, et al. Population study of causes, treatment, and outcome of infertility. Br Med J (Clin Res Ed) 1985;291:1693–7.

4. Evers JL. Female subfertility. Lancet 2002;360:151–9.

5. Tremellen K. Oxidative stress and male infertility—a clinical perspective. Hum Reprod Update 2008;14:243–58.

6. Sharpe RM, Irvine DS. How strong is the evidence of a link between environ-mental chemicals and adverse effects on human reproductive health? BMJ 2004;328:447–51.

7. Nakada K, Sato A, Yoshida K, Morita T, Tanaka H, Inoue S, et al. Mitochon-dria-related male infertility. Proc Natl Acad Sci USA 2006;103:15148–53.

8. Rapino C, Battista N, Bari M, Maccarrone M. Endocannabinoids as bio-markers of human reproduction. Hum Reprod Update 2014;20:501–16.

9. Devane WA, Dysarz FA, Johnson MR, Melvin LS, Howlett AC. Determination and characterization of a cannabinoid receptor in rat brain. Mol Pharmacol 1988;34:605–13.

10. Munro S, Thomas KL, Abu-Shaar M. Molecular characterization of a periph-eral receptor for cannabinoids. Nature 1993;365:61–5.

11. Taylor AH, Ang C, Bell SC, Konje JC. The role of the endocannabinoid system in gametogenesis, implantation and early pregnancy. Hum Reprod Update 2007;13:501–13.

12. Taylor AH, Amoako AA, Bambang K, Karasu T, Gebeh A, Lam PM, et al. En-docannabinoids and pregnancy. Clin Chim Acta 2010;411:921–30.

13. Karasu T, Marczylo TH, Maccarrone M, Konje JC. The role of sex steroid hor-mones, cytokines and the endocannabinoid system in female fertility. Hum Reprod Update 2011;17:347–61.

14. Bisogno T, Katayama K, Melck D, Ueda N, de Petrocellis L, Yamamoto S, et al. Biosynthesis and degradation of bioactive fatty acid amides in human breast cancer and rat pheochromocytoma cells—implications for cell prolif-eration and differentiation. Eur J Biochem 1998;254:634–42.

15. Piomelli D, Beltramo M, Giuffrida A, Stella N. Endogenous cannabinoid signaling. Neurobiol Dis 1998;5(6 Pt B):462–73.

16. El-Talatini MR, Taylor AH, Elson JC, Brown L, Davidson AC, Konje JC. Local-isation and function of the endocannabinoid system in the human ovary. PLoS One 2009;4:e4579.

17. Schuel H, Burkman LJ, Lippes J, Crickard K, Forester E, Piomelli D, et al. N-Acylethanolamines in human reproductive fluids. Chem Phys Lipids 2002;121:211–27.

18. Schuel H, Burkman LJ, Lippes J, Crickard K, Mahony MC, Giuffrida A, et al. Evidence that anandamide-signaling regulates human sperm functions required for fertilization. Mol Reprod Dev 2002;63:376–87.

1266 VOL. 102 NO. 5 / NOVEMBER 2014

19. Maccarrone M, Barboni B, Paradisi A, Bernabo N, Gasperi V, Pistilli MG, et al. Characterization of the endocannabinoid system in boar spermatozoa and implications for sperm capacitation and acrosome reaction. J Cell Sci 2005;118(Pt 19):4393–404.

20. Aquila S, Guido C, Santoro A, Gazzerro P, Laezza C, Baffa MF, et al. Rimo-nabant (SR141716) induces metabolism and acquisition of fertilizing ability in human sperm. Br J Pharmacol 2010;159:831–41.

21. Rossato M, Ion Popa F, Ferigo M, Clari G, Foresta C. Human sperm express cannabinoid receptor Cb1, the activation of which inhibits motility, acro-some reaction, and mitochondrial function. J Clin Endocrinol Metab 2005; 90:984–91.

22. Schuel H, Goldstein E, Mechoulam R, Zimmerman AM, Zimmerman S. Anandamide (arachidonylethanolamide), a brain cannabinoid receptor agonist, reduces sperm fertilizing capacity in sea urchins by inhibiting the acrosome reaction. Proc Natl Acad Sci USA 1994;91:7678–82.

23. Rossato M. Endocannabinoids, sperm functions and energy metabolism. Mol Cell Endocrinol 2008;286(Suppl 1):S31–5.

24. Schuel H, Burkman LJ. A tale of two cells: endocannabinoid-signaling regu-lates functions of neurons and sperm. Biol Reprod 2005;73:1078–86.

25. Lewis SE, Rapino C, Di Tommaso M, Pucci M, Battista N, Paro R, et al. Differ-ences in the endocannabinoid system of sperm from fertile and infertile men. PLoS One 2012;7:e47704.

26. Amoako AA, Marczylo TH, Marczylo EL, Elson J, Willets JM, Taylor AH, et al. Anandamide modulates human sperm motility: implications for men with asthenozoospermia and oligoasthenoteratozoospermia. Hum Reprod 2013;28:2058–66.

27. Ambrosini A, Zolese G, Ambrosi S, Ragni L, Tiano L, Littarru G, et al. Oleoy-lethanolamide protects human sperm cells from oxidation stress: studies on cases of idiopathic infertility. Biol Reprod 2006;74:659–65.

28. Ambrosini A, Zolese G, Ambrosi S, Bertoli E, Mantero F, Boscaro M, et al. Idiopathic infertility: effect of palmitoylethanolamide (a homologue of anan-

damide) on hyperactivated sperm cell motility and Ca2þ influx. J Androl 2005;26:429–36.

29. Ambrosini A, Zolese G, Wozniak M, Genga D, Boscaro M, Mantero F, et al. Idiopathic infertility: susceptibility of spermatozoa to in-vitro capacitation, in the presence and the absence of palmitylethanolamide (a homologue of anandamide), is strongly correlated with membrane polarity studied by Laur-dan fluorescence. Mol Hum Reprod 2003;9:381–8.

30. World Health Organization (WHO). Laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction. 4th ed. Cambridge, UK: Published on behalf of the World Health Organization by Cambridge University Press; 1999.

31. Amoako AA, Marczylo TH, Lam PM, Willets JM, Derry A, Elson J, et al. Quanti-tative analysis of anandamide and related acylethanolamides in human seminal plasma by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrom-etry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2010;878:3231–7.

32. Lam PM, Marczylo TH, Konje JC. Simultaneous measurement of three N-acy-lethanolamides in human bio-matrices using ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Anal Bioanal Chem 2010; 398:2089–97.

33. Bedu-Addo K, Barratt CL, Kirkman-Brown JC, Publicover SJ. Patterns of [Ca2þ](i) mobilization and cell response in human spermatozoa exposed to progesterone. Dev Biol 2007;302:324–32.

34. Lewis SE, Sterling ES, Young IS, Thompson W. Comparison of individual an-tioxidants of sperm and seminal plasma in fertile and infertile men. Fertil Steril 1997;67:142–7.

Fertility and Sterility®

35. Sikka SC. Relative impact of oxidative stress on male reproductive function. Curr Med Chem 2001;8:851–62.

36. Balercia G, Armeni T, Mantero F, Principato G, Regoli F. Total oxyradical scav-enging capacity toward different reactive oxygen species in seminal plasma and sperm cells. Clin Chem Lab Med 2003;41:13–9.

37. Lewis SE, Boyle PM, McKinney KA, Young IS, Thompson W. Total antioxi-dant capacity of seminal plasma is different in fertile and infertile men. Fertil Steril 1995;64:868–70.

38. Mínguez-Alarcon L, Mendiola J, Lopez-Espín JJ, Sarabia-Cos L, Vivero-Salmeron G, Vioque J, et al. Dietary intake of antioxidant nutrients is associ-ated with semen quality in young university students. Hum Reprod 2012;27: 2807–14.

39. Zareba P, Colaci DS, Afeiche M, Gaskins AJ, Jørgensen N, Mendiola J, et al. Semen quality in relation to antioxidant intake in a healthy male population. Fertil Steril 2013;100:1572–9.

40. Walczak-Jedrzejowska R, Wolski JK, Slowikowska-Hilczer J. The role of oxidative stress and antioxidants in male fertility. Cent Eur J Urol 2013;66: 60–7.

41. Gulaya NM, Kuzmenko AI, Margitich VM, Govseeva NM, Melnichuk SD, Goridko TM, et al. Long-chain N-acylethanolamines inhibit lipid peroxida-tion in rat liver mitochondria under acute hypoxic hypoxia. Chem Phys Lipids 1998;97:49–54.

42. Parinandi NL, Schmid HH. Effects of long-chain N-acylethanolamines on lipid peroxidation in cardiac mitochondria. FEBS Lett 1988;237:49–52.

43. Ross RA, Brockie HC, Pertwee RG. Inhibition of nitric oxide production in RAW264.7 macrophages by cannabinoids and palmitoylethanolamide. Eur J Pharmacol 2000;401:121–30.

44. Lepicier P, Bouchard JF, Lagneux C, Lamontagne D. Endocannabinoids protect the rat isolated heart against ischaemia. Br J Pharmacol 2003;139: 805–15.

45. Gebeh AK, Willets JM, Marczylo EL, Taylor AH, Konje JC. Ectopic preg-nancy is associated with high anandamide levels and aberrant expression of FAAH and CB1 in fallopian tubes. J Clin Endocrinol Metab 2012;97: 2827–35.

46. Schuel H. Tuning the oviduct to the anandamide tone. J Clin Invest 2006; 116:2087–90.

47. Gervasi MG, Rapanelli M, Ribeiro ML, Farina M, Billi S, Franchi AM, et al. The endocannabinoid system in bull sperm and bovine oviductal epithe-lium: role of anandamide in sperm-oviduct interaction. Reproduction 2009;137:403–14.

48. Osycka-Salut C, Gervasi MG, Pereyra E, Cella M, Ribeiro ML, Franchi AM, et al. Anandamide induces sperm release from oviductal epithelia through nitric oxide pathway in bovines. PLoS One 2012;7: e30671.

49. Zolese G, Wozniak M, Mariani P, Saturni L, Bertoli E, Ambrosini A. Different modulation of phospholipase A2 activity by saturated and monounsatu-rated N-acylethanolamines. J Lipid Res 2003;44:742–53.

50. Ambrosini A, Tanfani F, Bertoli E, Wozniak M, Wypych Z, Zolese G. Effect of N-acylethanolamines with different acyl-chains on DPPC multilamellar lipo-somes. Chem Phys Lipids 1993;65:165–9.

51. Ambrosini A, Bertoli E, Mariani P, Tanfani F, Wozniak M, Zolese G. N-Acyle-thanolamines as membrane topological stress compromising agents. Bio-chim Biophys Acta 1993;1148:351–5.

52. Ambrosini A, Zolese G, Balercia G, Bertoli E, Arnaldi G, Mantero F. Laurdan fluorescence: a simple method to evaluate sperm plasma membrane alter-ations. Fertil Steril 2001;76:501–5.

VOL. 102 NO. 5 / NOVEMBER 2014 1267